MicroRNA前体表达克隆

MicroRNA (miRNA)是从真核基因组转录形成的非编码单链小分子RNA。它们的序列高度保守，通常是21到23个核苷酸长度。近来研究发现miRNA几乎与所有细胞的功能和生物体生命过程有关。它们通过靶定到mRNA3’非翻译区（3'－UTR）来调节基因的表达。MicroRNA所调节基因的表达失调与癌症、心血管疾病、其他各种疾病有关。

复能基因现在提供:

• 700多种人类的OmicsLink™ microRNA前体表达克隆
• miRNA靶标的表达克隆编码基因的3’端非翻译区（3’－UTR）涵盖了人类编码基因20000个miRNA靶标表达克隆。（3’－UTR，即编码基因的3’端非翻译区）

利用这些miRNA表达克隆研究相应基因或者蛋白的表达调节情况。配合采用荧光素酶报告基因的靶标克隆，可以和miRNA表达克隆一起进行miRNA功能筛选合确证，以及miRNA靶标基因的筛选和确证的交互实验。

复能基因同时也提供多套的人类基因组和小鼠基因组的全长基因ORF表达克隆。用于miRNA靶标的对应蛋白的功能互补实验。由于这些ORF克隆不含3’－UTR，可以用于特种miRNA对内源靶基因抑制后的拯救实验，进一步确证miRNA功能及靶标基因。

OmicsLink™人类基因组的miRNA前体表达克隆       

复能基因采用基于猫免疫缺陷病的慢病毒系统，构建了miRNA前体表达克隆的载体骨架。RNA聚合酶III型的H1启动子驱动转录前体miRNA的茎环前体（大约有150核苷酸长度）。 随后通过RNAi的酶系加工生成成熟的miRNA。使得在同一载体的CMV启动子的驱动下共表达报告基因eGFP，双顺反子下游的新霉素筛选基因也同时表达。可作为监测miRNA表达，转染和转化的效率的参考标准。

RISC－miRNA复合体通过结合靶基因的mRNA的3’非编码区（3’－UTR）成功地调节靶基因。1）表达水平和翻译水平的抑制；2）mRNA的被切割，被降解和丰度的下降。

慢病毒骨架的pre-miRNA表达克隆介导的miRNA基因的调节

miRNA前体表达克隆的特征

• 700多种前体miRNA表达克隆涵盖了miRBase（14.0版本）中已知miRNA的95%
• miRNA表达框已完全测序确证
• 基于慢病毒载体系统的表达克隆可转染未分化细胞和难转化的细胞，获得与普通分化细胞类似的转染效率
• 提供被转染细胞的存活性的筛选基因，可用于稳定或瞬时表达调控
• 通过应用eGFP可以监测病毒和质粒载体的转染效率

参考文献:

• Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T; "Identification of novel genes coding for small expressed RNAs"; Science. 294:853-858(2001).
• Suh MR, Lee Y, Kim JY, Kim SK, Moon SH, Lee JY, Cha KY, Chung HM, Yoon HS, Moon SY, Kim VN, Kim KS; "Human embryonic stem cells express a unique set of microRNAs"; Dev Biol. 270:488-498(2004).
• Dostie J, Mourelatos Z, Yang M, Sharma A, Dreyfuss G; "Numerous microRNPs in neuronal cells containing novel microRNAs"; RNA. 9:180-186(2003).
• Michael MZ, O' Connor SM, van Holst Pellekaan NG, Young GP, James RJ; "Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia"; Mol Cancer Res. 1:882-891(2003).
• Kasashima K, Nakamura Y, Kozu T; "Altered expression profiles of microRNAs during TPA-induced differentiation of HL-60 cells"; Biochem Biophys Res Commun. 322:403-410(2004).
• Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, Sewer A, Iovino N, Aravin A, Pfeffer S, Rice A, Kamphorst AO, Landthaler M, Lin C, Socci ND, Hermida L, Fulci V, Chiaretti S, Foa R, Schliwka J, Fuchs U, Novosel A, Muller RU, Schermer B, Bissels U, Inman J, Phan Q, Chien M, Weir DB, Choksi R, De Vita G, Frezzetti D, Trompeter HI, Hornung V, Teng G, Hartmann G, Palkovits M, Di Lauro R, Wernet P, Macino G, Rogler CE, Nagle JW, Ju J, Papavasiliou FN, Benzing T, Lichter P, Tam W, Brownstein MJ, Bosio A, Borkhardt A, Russo JJ, Sander C, Zavolan M, Tuschl T; "A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing"; Cell. 129:1401-1414(2007).
• Lui WO, Pourmand N, Patterson BK, Fire A; "Patterns of known and novel small RNAs in human cervical cancer"; Cancer Res. 67:6031-6043(2007).
• Marton S, Garcia MR, Robello C, Persson H, Trajtenberg F, Pritsch O, Rovira C, Naya H, Dighiero G, Cayota A; "Small RNAs analysis in CLL reveals a deregulation of miRNA expression and novel miRNA candidates of putative relevance in CLL pathogenesis"; Leukemia. 22:330-338(2008).