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全长ORF克隆常见问题解答：
- 1. 什么是全长ORF克隆？
- 答：一个全长ORF（开放阅读框）克隆是指一个插入有编码全长蛋白质的DNA片断的质粒。该插入DNA片断只含有编码一个全长蛋白质的序列（从起始密码到终止密码），而不包含有5′或3′端的非翻译区（UTRs）或内含子。
- 2. 为什么应该选择全长ORF克隆而非其他的全长cDNA克隆？
- 答：全长ORF克隆只含有全长蛋白质的编码序列而其他全长cDNA克隆则还包含一些非翻译的序列，如5'端或3'端非翻译区。众所周知,在表达宿主中, 这些非翻译的序列可能会对所需编码蛋白质的转录和翻译过程有负面的影响。如想进一步详细的比较这两种类型的克隆请访问这个网页:(http://www.genecopoeia.com/tech/omicslink/application.php).
- 3. 为什么说ORFEXPRESS™ 穿梭克隆是与Gateway®克隆技术是相兼容的？
- 答：ORFEXPRESS™ 穿梭克隆载体是由美国GeneCopoeia公司构建。其特点是通过重组技术把在重组位点attL1和attL2间的全长ORF整合到Gateway® pDEST系列的表达克隆的attR1和attR2重组位点间。并且，GeneCopoeia的ORFEXPRESS™穿梭克隆和Gateway®系列的pDEST表达系列载体，在最适的温度和酶浓度下反应；在穿梭克隆上的ORF就被转移到Gateway®系列的pDEST表达系列载体上。由于表达载体重组位点的特点，ORF会被准确地转移到表达克隆的载体的启动子下游。
- 4. 怎样选择合适的表达载体把感兴趣的ORF 从ORFEXPRESS™ 穿梭克隆转移到表达载体？
- 答：Invitrogen公司有一系列的pDEST表达载体（目标载体）和ORFEXPRESS™ 穿梭克隆相匹配，这些载体可以在细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等不同的宿主中表达各种类型的蛋白（如天然的、N-端或C-段的融合蛋白）。但是, 为你科研的更加方便, GeneCopoeia 和广州复能基因有限公司已经构建了解30多中OmicsLink™ 表达克隆。 不需要你花费任何时间和进行任何克隆工作，这些克隆可以在许多表达宿主和无细胞转录—翻译体系表达多种含有不同标签蛋白的蛋白， 以利于表达蛋白的可容性，纯化，细胞定位和固相化。
- 5. 你们是如何选择克隆在ORFEXPRESS™ 穿梭克隆的全长ORFs的？
- 答：选择过程是十分严格的。包括从多种cDNA数据库和基因组数据库中全长编码基因序列的提取、比较和确认以及相关信息的注释。通过计算机聚类和人工校正的方法来减低冗余并排除错误的基因。
- 6. 可不可以用ORFEXPRESS™ 穿梭克隆表达一个含有N端或C端标签蛋白的融合蛋白质？
- 答：可以，有两个选择。你可选用我们开发和构建的OmicsLink™ 表达克隆。此表达克隆已经将ORF构建在N端或C端带有不同标签蛋白的表达载体,请到网页 (http://www.genecopoeia.com/tech/omicslik/)。 上查询OmicsLink™的产品信息。另一种选择，你也可以用Invitrogen的表达N-端或C-端的融合蛋白的Gateway® 表达载体。然而，因为我们的ORFEXPRESS™穿梭克隆的ORF含有终止密码子，把ORF转移到Invitrogen的pDEST表达载体之前需要除去终止密码子，才可以表达含有C端标签蛋白的融合蛋白。
- 7. 当表达C-端融合蛋白时如何把全长ORF上的终止密码子除去？
- 答：可以通过点突变的方法去除终止密码子。我们大约已经构建了20,000多个在3′端带有不同标签蛋白序列的全长ORF OmicsLink™ 表达克隆（Expression Clones）(http://www.genecopoeia.com/tech/omicslink/). 你只要付一小笔额外的费用，我们可以除去终止密码子并把它克隆到你所需要的载体。
- 8. 我想把ORFEXPRESS™ 穿梭克隆上的ORF转移到自己的含有某些特征的载体里去，但这些载体不与Gateway®兼容的，怎么办？
- 答：每一个ORFEXPRESS™ 穿梭克隆中的ORF两侧都有两个多克隆位点（MCS）。你可通过选择合适的内切酶， 在ORFEXPRESS™ 穿梭克隆上切出完整的ORFs, 并运用经典的亚克隆方法将ORFs构建到你所需要的载体。
- 9. 如果我用Gateway®克隆系统表达N端融合蛋白，ORFEXPRESS™穿梭克隆上的重组位点(attB)和多克隆位点将会成为编码序列，那么有多少个氨基酸被添加到标签蛋白和所需蛋白的N末端之间？
- 答：融合多肽与ORF之间有14个氨基酸残基，其中AttB重组位点编码8个氨基酸(Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly)，另外六个氨基酸则是由AttB和ORF起始密码子（ATG）之间的序列编码。
- 10. 你们的OmicsLink™ 表达克隆与Gateway® pDEST目的载体（表达载体）构建的表达克隆有何区别？
- 答：广州复能基因有限公司的 OmicsLink™ Expression Clones是根据其专利克隆技术ReJion产生的。使用该技术表达5'-标签-ORF融合蛋白，5'标签与全长ORF的起始密码子ATG之间不会有attB位点。因此使用OmicsLink™ Expression clones 将不会带有Invitrogen的 pDEST 载体中由attB位点编码的额外8个氨基酸。表达3'融合蛋白的情况也是相同的。
- 11. ORFEXPRESS™ 穿梭克隆的筛选标记是什么？
- 答：卡那霉素。
- 12. OmicsLink™ 表达克隆的筛选标记是什么？
- 答：氨苄青霉素。
- 13. 多克隆位点（MCS）的序列是什么？
- 答：多克隆位点（MCS）序列是根据你所购买的ORFEXPRESS™ 穿梭克隆和 OmicsLink™表达克隆上全长ORF的不同而决定的。首先你要核对随产品邮寄的数据表里的信息，并通过如下图示的简图确认序列。
图1 例：产品目录号为GC-B0128的多克隆位点。
- 答：多克隆位点（MCS）序列是根据你所购买的ORFEXPRESS™ 穿梭克隆和 OmicsLink™表达克隆上全长ORF的不同而决定的。首先你要核对随产品邮寄的数据表里的信息，并通过如下图示的简图确认序列。
- 14. 你们的网页上相关基因/克隆所注释的序列与你提供的克隆的实际序列是否一致？
- 答：不，你所看到的序列并非我们的克隆的实际序列。该序列是从NCBI （GenBank）上序列记录中选择出来的 并用以设计5′和3′端引物以及合成全长ORF的参考序列。
- 15. 在某些情况下，当比较你们的参照序列与NCBI上具有相同基因名称或描述的序列时，发现这两者间有一定程度上的差异。您如何解释这种矛盾？
- 答：由于编码基因的多选择性剪接，以及从不同实验室关于ORFs、多态性或由于克隆复制出现冗余等的最新信息，一个基因座上的基因通常有多个转录产物。因此在选择基因全长的ORF克隆时，我们尽量选择每个基因座上最有代表性的转录本，这个转录本与同一基因座上的其他转录产物可能会有轻微的或者是显著的差别。这种方法能最广泛的覆盖所有的基因座。在许多情况下，我们在ORFs的克隆过程中能得到多种同一编码基因的多种剪接异构体。如果客户对某一特定的异构体/ORF感兴趣，欢迎送Email到inquiry@genecopoeia.com咨询详情。
- 16. 我在你们公司的网页的数据库中找不到我所需要的基因，你们能为我克隆该基因吗？价格如何？
- 答：是的，我们可以为你克隆你所需要的基因。我们的目标是克隆人类所有基因的全长ORF，我们正朝这方面努力。你所感兴趣的基因有可能已在我们的生产线上或即将进行克隆。如果你给我们提供GenBank 登记号、基因名称、核苷酸或氨基酸序列的信息，我们会将该基因安排到优先生产的列表上，尽快为你克隆。通常完成克隆需要两周的时间，尽管我们不能完全保证能在这时间内得到该基因。一旦克隆成功我们会尽快通知你。这项服务不需要附加费用。
- 17. 你们是如何对你们的克隆进行质量控制的？
- 答：每一个全长ORF克隆都按以下步骤进行质量的控制：1)限制性酶切检测；2)用特异性引物进行PCR检测ORF的长度；3) 5' 和 3'端测序确认每一个ORF两端至少400-500bp的序列。另外，在每个克隆投递給你之前，我们会再次用ORF特异性的核酸引物进行PCR验证，确保投递的克隆正确无误。
- 18. 你们的ORF有经过全长的测序吗？
- 答：作为我们质量控制过程最重要的步骤，我们对所有的ORF的5’ 和3’ 两端共1100到1200个碱基进行了测序。对于小于1200bp的ORF，对全ORF序列进行了测序。对于长度超过1100bp 的ORF克隆，我们以成本价提供对ORF克隆进行全长测序的服务。由于目前对所有克隆的全长ORF进行测序的费用昂贵并且耗时，所以如进行全长测序将会不可避免的延长交货时间和提高克隆的价格。
- 19. 我想对ORFs进行测序，我需要用什么引物？
- 答：对于ORFEXPRESS™ 穿梭克隆，正向测序引物（ORF 5'端上游）是：5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG,反向引物（ORF 3'端下游）是5'-ATGGTCATAGCTGTTTCCTG。对于OmicsLink™ clones，你可在我们的网页上查阅测序引物的序列。
- 20. 你们是如何生产全长的ORF的？
- 答：我们结合多种专利技术以提高PCR的保真度，通过PCR把全长的ORF扩增出来（详见ORF白皮书）。我们采用70多种人组织cDNA 文库作为模板来生产全长ORF。
- 21. 如何解释你们实际序列与GenBank上序列的差异？
- 答：有两种不同的可能或两者兼而有之的可能：1）自然因素，包括遗传多态性、选择性剪接方式、NCBI数据库注释的更新导致基因的多个版本、数据递交者的DNA测序的错误或着模糊不清；2）PCR过程导致的改变。购买ORF克隆的用户往往只是将我们的ORF测序与数据库的基因的某个参照版本的序列进行比较，而把任何的差异都认为是由于PCR产生的突变。通过对将近20,000我们克隆的人类基因的多个克隆的分析，比较了我们的序列与数据库的所有的转录本和相应基因座上的序列包括基因组序列、ESTs、其他cDNA/mRNA 转录本，我们发现大部分差异很明显来源于遗传多态性和选择性剪接方式而不是PCR产生的。 我们的ORF序列与相应的基因组的差异要比数据库发表的基因转录本与相应的基因组的差异要小。当然我们不能完全排除PCR过程导致的突变的可能性，但我们相信这样的可能性是非常低的。我们也可以廉价的提供使用非PCR的方法改变单核苷酸的组成的服务。
- 22. 因为是用PCR的方法扩增全长ORFs，你们将如何处理从你们那里购买的由于PCR产生的突变的ORF克隆？
- 答：我们的系统结合了一些新的、高保真的PCR专利技术，这些方法可以使扩增全长ORFs的保真度提高10倍。它是通过在低的反应温度下减少引物与模板DNA的非特异结合以及减少扩增所需的循环数来达到高保真的目的的。由于遗传多态性和基因的多选择性剪接方式，我们只保证在我们的全长ORF序列没有移码突变也不会引入终止密码子。如果发生上述情况，我们将更换有问题的克隆或者退还所收费用。
- 23. 在序列上有一个核苷酸碱基的改变，而且它所编码的氨基酸正是位于许多文献上报道的蛋白的活性位点，你们将会如何处理？
- 答：对于这类情况，尽管我们不提供无偿克隆替换，但是我们可以廉价地提供突变服务（可以改变任意地核苷酸组成）
- 24. 通过全序列测序，我发现这是我感兴趣的基因中的一个选择性剪接体，你们能重新克隆或替换它吗？
- 答：我们将尽最大的努力克隆原始的剪接形式为你提供有偿替换的克隆。但是，我们不能保证一定能得到特异的剪接体的克隆也不能确定获的克隆的具体日期。
- 25. 你们对每一个基因都做过表达了吗？
- 答：我们进行了所有全长ORFs 用pReceiever-B01载体和一种表达宿主细胞（E. coli）在一种表达条件的表达实验。我们没有用其它表达宿主细胞和其它表达条件对所有全长ORFs进行蛋白表达的检测。
- 26. 我做了表达实验，但却没有目标蛋白的表达，为什么？
- 答：一个带有启动子的正确的ORF DNA序列并不能保证相应的蛋白的表达。影响重组蛋白表达的因素很多：1)你选用的的表达载体是否与你的宿主相匹配，如pReceiver-M01是在哺乳动物细胞中表达的，而pReceiver-B01则是在细菌里表达的。2）如果表达的是一个膜蛋白，它是否需要在细胞内定位的靶序列。3）过量表达的蛋白对宿主是否存对表达宿主细胞有毒性作用？4) 该蛋白质是否正确折叠成有功能或者能适合免疫分析所需的三级结构？5）如果用一特异的单克隆抗体检测蛋白表达，最好做全长ORF的DNA测序以确定你是否得到一个不同的ORF剪接体。
- 27. 你们有其他种属的ORFs吗？
- 答：目前我们只提供已经克隆好的人源的ORFs克隆。我们正在生产模式动物如大鼠和小鼠的全长ORF克隆。这些克隆不久将投放到市场。如果你对这些模式动物的任何基因的全长ORF感兴趣，请把这些基因的GenBank 登记号或核苷酸序列的信息给我们。我们将优先将它的全长ORF克隆到我们提供的载体里面。所需的价格与产品目录上提供的克隆的价钱是一样的。我们也能按你的要求将基因克隆到你所指定的载体里。
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